T4 DNA连接酶
中文名称： T4 DNA连接酶
英文名称： T4 DNA Ligase
产品规格： BR,1u/ul
包装： LC1000U
产品规格： BR,5u/ul
包装： 200U/1000U
产品规格： BR,30u/ul
包装： HC5000U
CAS号：9015-85-4
分子量：55.3kDa，单体
T4 DNA连接酶级别：BR
分子量：55.3kDa，单体
来源：含有T4噬菌体克隆基因30的大肠杆菌
浓度：1u/ul(200CEU/ul）
浓度：5Weiss u/ul(1000CEU/ul）
浓度：30Weiss u/ul(6000CEU/ul）
活性定义：是指在ATP-PPi交换反应中，37℃、30分钟内将1nmol [32PPi]转换为Norit可吸收形式所需的酶量（weiss单位，1个weiss单位相当于约200个粘性末端连接单位。1个粘性末端连接单位：20ul反应体系（50mM Tris-HCL(PH7.5), 10mM DTT, 10mM MgCL2, 1mM ATP, 25ug/ml BSA, 12uM(300ug/ml)的5-DNA末端）中，在16℃、30分钟内连接50%连接HindIII酶切的Lambda DNA 产物所需的酶量）
酶活性分析混合物：66mM Tris-HCL(PH7.6), 10mM DTT, 6.6mM MgCL2, 0.066mM ATP, 3.3uM[32PPi]
保存液组分：20mM Tris-HCL(PH7.5), 50mM KC1, 1mM DTT，0.1mM EDTA和50%(v/v)甘油
10×T4 DNA Ligase缓冲液（#B69）：400mM Tris-HCL, 100mM MgCL2, 100mM DTT, 5mM ATP(PH7.5,25℃)
抑制剂：当反应体系中NaC1或KC1的浓度超过200 mM时，可强烈抑制T4 DNA Ligase活性
失活：65℃加热10分钟或70℃加热5分钟
注意：T4 DNA Ligase与DNA结合会改变条带的琼脂糖凝胶电泳迁移率，为避免此现象，电泳前需处理样本或分子量标准。样本处理如下：样本与Fermentas公司6×DNA Loading Dye&SDS溶液（#R1151）混合，75℃加热5分钟或65℃加热10分钟后冰浴保存；转化时，连接产物的体积不得超过感受态细胞体积中的10%；电转化之前，先用氯仿抽提方法除去连接混合物中的T4 DNA Ligase，然后经乙醇沉淀纯化抽提产物
质量控制：测试表明无内切脱氧核糖核酸酶、核糖核酸酶、磷酸酶污染。功能检测：粘性末端或平末端DNA的连接能力
性状：液体。该酶催化双链DNA或RNA中毗邻的5'磷酸基团和3'-羟基末端之间形成磷酸二酯键，还可以修复双链DNA、RNA或DNA/RNA复合体中的单链切口，连接DNA的粘性和平末端，但该酶对单链核酸无酶活性。该酶需要辅因子ATP
T4 DNA连接酶用途：生化研究。粘性末端或平末端双链DNA的连接；双链寡核苷酸接头与双链DNA连接；双链DNA、RNA或DNA-RNA复合体中缺口的修复；连接酶介导的RNA检测；位点特异性突变；扩增片段长度多态性
保存： -20°C
T4 DNA连接酶内容及其配制
T4 DNA连接酶自备材料
1）蒸馏水。
2）加样器：5ul、10ul、50ul、100ul、200ul、500ul、1000ul。
3）振荡器及磁力搅拌器等。
T4 DNA连接酶安全性
1）避免直接接触终止液和底物A、B。一旦接触到这些液体，请尽快用水冲洗。
2）实验中不要吃喝、抽烟或使用化妆品。
3）不要用嘴吸取试剂盒里的任何成份。
T4 DNA连接酶操作注意事项
1）试剂应按标签说明书储存，使用前恢复到室温。稀稀过后的标准品应丢弃，不可保存。
2）实验中不用的板条应立即放回包装袋中，密封保存，以免变质。
3）不用的其它试剂应包装好或盖好。不同批号的试剂不要混用。保质前使用。
4）使用一次性的吸头以免交叉污染，吸取终止液和底物A、B液时，避免使用带金属部分的加样器。
5）使用干净的塑料容器配置洗涤液。使用前充分混匀试剂盒里的各种成份及样品。
6）洗涤酶标板时应充分拍干，不要将吸水纸直接放入酶标反应孔中吸水。
7）底物A应挥发，避免长时间打开盖子。底物B对光敏感，避免长时间暴露于光下。避免用手接触，有毒。实验完成后应立即读取OD值。
8）加入试剂的顺序应一致，以保证所有反应板孔温育的时间一样。
9）按照说明书中标明的时间、加液的量及顺序进行温育操作。
T4 DNA连接酶样品收集、处理及保存方法
1）血清-----操作过程中避免任何细胞刺激。使用不含热原和内毒素的试管。收集血液后，1000×g离心10分钟将血清和红细胞迅速小心地分离。
2）血浆-----EDTA、柠檬酸盐、肝素血浆可用于检测。1000×g离心30分钟去除颗粒。
3）细胞上清液---1000×g离心10分钟去除颗粒和聚合物。
4）组织匀浆-----将组织加入适量生理盐水捣碎。1000×g离心10分钟，取上清液
5）保存------如果样品不立即使用，应将其分成小部分-70 ℃保存，避免反复冷冻。尽可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量颗粒，检测前先离心或过滤。不要在37℃或更高的温度加热解冻。应在室温下解冻并确保样品均匀地充分解冻。
T4 DNA连接酶试剂的准备
1）标准品：标准品的系列稀释应在实验时准备，不能储存。稀释前将标准品振荡混匀。
2）洗涤缓冲液（50×）的稀释：蒸馏水50倍稀释。
T4 DNA连接酶操作步骤
1）使用前，将所有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9）在450nm波长处测定各孔的OD值。
T4 DNA连接酶局限
6号标准品以上的结果为非线性的，根据此标准曲线无法得到精确的结果。
T4 DNA连接酶性能
1. 灵敏度：最小的检测浓度小于1号标准品。稀释度的线性。样品线性回归与预期浓度相关系数R值为0.990。
2. 特异性：不与其它细胞因子反应。
3. 重复性：板内、板间变异系数均小于10%。
T4 DNA连接酶结果判断与分析
1、仪器值：于波长450nm的酶标仪上读取各孔的OD值
2、以吸光度OD值为纵坐标（Y），相应的待测物质标准品浓度为横坐标（X），做得相应的曲线，样品的待测物质含量可根据其OD值由标准曲线换算出相应的浓度。
